大腸桿菌通用PCR試劑盒(含致病性和非致病性)說(shuō)明書(shū)
樣本處理及要求：
1.血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
試劑盒組成及試劑配制： 1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶
4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。 ②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。 ③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 ⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。 ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。 ⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。 引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 操作流程: 1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。 2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL； 3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。 4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。 5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。 6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。 7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。 樣本：血清 血漿 組織勻漿等液體樣本 標(biāo)記物：血清 血漿 組織勻漿等 應(yīng)用：僅用科研實(shí)驗(yàn)檢測(cè)定量，定性檢 檢測(cè)方法：夾心法 技術(shù)要求：全程按說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)，操作規(guī)范，專(zhuān)業(yè)，儀器設(shè)備齊全。 規(guī)格：48t/96t 性狀：液體 運(yùn)輸方式：快遞發(fā)貨 有效期：6個(gè)月品 特點(diǎn)：靈敏性高，---性，吸附均勻，吸附性好，回收利用率高，是一款可以讓您放心選購(gòu)的產(chǎn)品。 使用范圍：此產(chǎn)品供科研實(shí)驗(yàn)使用，不得用于---。 用途：用于測(cè)定人血清、血漿、組織及相關(guān)液體樣本中的含量或活性。 注：本公司提供試劑盒免費(fèi)代測(cè)服務(wù)。需要其他檢測(cè)試劑盒請(qǐng)咨詢(xún)銷(xiāo)售人員。
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